293來源病毒包裝細胞;ΦA操作步驟:
1)貼壁細胞傳代:提前將培養(yǎng)基、PBS放入37℃水浴鍋內(nèi)預熱,用75%酒精擦拭后再放入超凈臺內(nèi),吸除或倒掉細胞瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液,加少量PBS潤洗細胞,加入適量胰酶,使胰酶的量能蓋住細胞,37℃孵育,每隔2~3min顯微鏡下觀察,待貼壁細胞間間隙變大、細胞趨于圓形但還未漂起時棄去胰酶,加入新鮮培養(yǎng)基,晃動細胞瓶,終止胰酶作用,用吸管小心吹打貼壁的細胞,制成細胞懸液??刂拼荡虻牧Χ龋苊猱a(chǎn)生大量的氣泡,將細胞懸液分別接種到另外的2~3個細胞瓶內(nèi),加入新鮮培養(yǎng)基,置37℃溫箱培養(yǎng),隔天觀察貼壁生長情況。
2)懸浮細胞傳代:將細胞懸液轉(zhuǎn)移到無菌離心管內(nèi),1000rpm離心5min,棄去上清,加入新鮮的培養(yǎng)基,用吸管小心吹散沉淀,制成細胞懸液,將細胞懸液分別接種到另外的2~3個細胞瓶內(nèi),加入新鮮培養(yǎng)基,置37℃溫箱培養(yǎng)。
3)病毒包裝準備:待細胞生長至適宜密度(通常約為70%-80%匯合),進行病毒包裝前的預處理。移除細胞瓶中的培養(yǎng)基,用PBS輕柔洗滌細胞兩次,以去除殘留的培養(yǎng)基成分和死細胞。根據(jù)所使用的病毒包裝系統(tǒng)(如慢病毒、腺相關病毒等),配制好相應的包裝質(zhì)粒和輔助質(zhì)?;旌衔?,以及轉(zhuǎn)染試劑。確保所有操作均在無菌條件下進行,避免污染。
4)病毒轉(zhuǎn)染:將包裝質(zhì)?;旌衔锱c轉(zhuǎn)染試劑按預定比例混合,輕輕顛倒混勻后,室溫靜置一段時間(如15-20分鐘),以形成轉(zhuǎn)染復合物。隨后,將此復合物逐滴加入到細胞瓶中,輕輕搖晃細胞瓶以確保均勻分布。將細胞瓶放回37℃溫箱,繼續(xù)培養(yǎng)。
5)病毒收集與純化:轉(zhuǎn)染后48-72小時,根據(jù)細胞狀態(tài)和病毒產(chǎn)生情況,收集細胞上清液。利用超速離心、病毒純化柱或親和層析等方法,對病毒顆粒進行純化,以提高病毒滴度和去除雜質(zhì)。純化后的病毒可儲存于-80℃冰箱,供后續(xù)實驗使用。在整個操作過程中,需嚴格遵循生物安全規(guī)范,防止病毒泄露和交叉感染。